» » » Анализ метаболизма клеток


Клеточный метаболизм необходим для нормальной физиологии у всех организмов. Для определения и измерения клеточного метаболизма используются различные анализы, в зависимости от исследуемого метаболита.

Обнаружение глюкозы

2-NBDG (2-(N-(7-нитробенз-2-окса-1,3-диазол-4-ил)амино)-2-диоксиглюкоза) анализ

Измерение поглощения глюкозы внутри клеток важно для оценки нескольких биологических процессов и их болезненных состояний. Например, измерение уровня глюкозы во время диабета является критическим. 2-NBDG представляет собой флуоресцентный белок и аналог глюкозы.

В этом анализе 2-NBDG непосредственно инкубируют с клетками. Через некоторое время интенсивность флуоресценции внутри клеток измеряется с помощью проточной цитометрии. Этот анализ также используется для измерения изменений в поглощении глюкозы в присутствии различных антидиабетических препаратов.

Анализ глюкозооксидазы

10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин представляет собой пероксидазный субстрат. Поскольку и глюкозооксидаза, и реакции пероксидазы связаны, этот анализ может быть использован для измерения активности и уровня глюкозы внутри клеток, пищевых продуктов и жидкостей организма.

В этом анализе глюкозооксидаза реагирует с глюкозой с образованием перекиси водорода. Перекись водорода затем реагирует с реагентом (Ampex Red) с образованием красного флуоресцентного белка, называемого резорфином. Уровни этого красного флуоресцентного белка могут затем могут использоваться для анализа уровней глюкозы.

Холестерин

Анализ перекиси водорода и холестерина

Холестерин существует внутри клеток в форме как свободного холестерина, так и сложных эфиров холестерина. В этом анализе используется соединение, которое реагирует с H2O2, продуцируемым окислением холестерина, в результате чего продуцируется флуоресцентное соединение. Этот анализ может измерять как свободные холестерины, так и сложные эфиры холестерина.

Фосфатидилхолинспецифическая фосфолипаза C (PC-PLC)

В этом анализе в качестве зонда используют 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазин. PC-PLC может превращать фосфатидилхолин в фосфохолин и диацилглицерин.

Щелочная фосфатаза затем превращает фосфорилхолин в холин, который затем окисляется с образованием перекиси водорода. Эта перекись водорода затем может реагировать с 10-ацетил-3,7-дигидроксифеноксазином с образованием красного флуоресцентного белка, называемого резоруфином.

Флуоресцентный сигнал может быть обнаружен с помощью микроскопии. Анализ PC-PLC является чувствительным.

Обнаружение АТФ

Этот анализ использует рекомбинантную люциферазу светлячков и ее субстрат (D-люциферин) для определения уровней АТФ внутри клеток. Люцифераза дает свет в присутствии АТФ. Этот анализ очень чувствителен и может обнаруживать 0,1 пикомола ранее существовавшего или новообразованного АТФ.

Этот анализ может быть использован для обнаружения изменений АТФ при различных ферментативных реакциях и бактериальном загрязнении в крови, молоке, моче и почве. Его также можно использовать для анализа клеточной пролиферации, цитотоксичности, эффектов антибиотиков и противораковых лекарств.

Галактозо-галактозооксидазный анализ

Этот анализ используется для определения уровней галактозы внутри клеток. В этом анализе галактозооксидаза используется для катализации галактозы с образованием перекиси водорода.

Перекись водорода затем реагирует с соединением Ampex Red для получения красного флуоресцентного белка, называемого резоруфином. Флуоресценцию резоруфина измеряют и используют в качестве индикатора уровней галактозы в образце.

Как и метаболизм клеток, анализ галактозо-галактозооксидазы может быть использован для изучения клеточной сигнализации, нейробиологии, воспалений, иммунной функции. Флуоресценция, создаваемая резоруфином, стабильна как минимум 3 часа.