» » » Кристаллизация белка


Кристаллизация белка является важным инструментом для очистки белков, а также для демонстрации их химической чистоты.

Этот процесс необходим для рентгеновской кристаллографии, которая внесла огромный вклад в наше понимание атомной и молекулярной структуры даже на уровне белка и нуклеиновой кислоты. Эти кристаллы помогают определять трехмерную структуру сложных макромолекул и их функции, а также то, как они действуют в реальном мире.

Принцип

Кристаллизация белков основана на тщательной комбинации перенасыщенного раствора соединения с осаждающими или кристаллизующими реагентами в правильных лабораторных условиях для индуцирования зарождения и роста кристалла белка.

Процедура

Для кристаллизации белка следует пройти через три следующих этапа:

Характеристика белка

Необходимо очистить, по меньшей мере, несколько миллиграммов белка и затем провести спектроскопию кругового дихроизма для изучения структуры и активности белка, дифференциальную сканирующую флюорометрию и динамическое рассеяние света, которое обеспечит низкую полидисперсность или ультрацентрифугирование. Также необходимо изучить стабильность белка в присутствии различных добавок и лигандов. Этот шаг необходим для успеха кристаллографии.

Кристаллизация белка

Этот процесс зависит от физических и химических законов и является результатом осаждения пересыщенного белкового раствора. Невозможность использовать высокие температуры для достижения пересыщения белков преодолевается с использованием других факторов, таких как различные типы соли в буферном растворе или с использованием кофакторов для повышения растворимости белка. Обычно используемые осадки включают сульфат аммония и полиэтиленгликоль. Коммерческие готовые экранирующие растворы используются для определения условий, которые благоприятствуют кристаллизации белка. Эти условия затем оптимизируются для обеспечения роста крупных кристаллов, которые могут быть подвергнуты рентгеновской кристаллографии.

Трудности с кристаллизацией белка

Образец должен быть подготовлен и очищен с осторожностью и солюбилизирован в правильной буферной среде для получения кристаллов. Максимальная чистота и монодисперсность – цель подготовки образца.

Стабильность – еще одна главная проблема. Хранение должно предотвращать любое ухудшение с точки зрения конформационного изменения или денатурации, олигомеризации или любых таких изменений до или во время процесса кристаллизации.

Затем пересыщение достигается с использованием правильной комбинации реагентов, рН буфера, правильной температуры и эксципиентов или добавок. Молекулы белка поощряются к упорядоченному взаимодействию без осаждения или разделения фаз или беспорядочной агрегации. Когда нуклеация индуцируется соответствующим образом, с достаточным количеством, размером и качеством, окружающая среда должна иметь тенденцию ограничивать дальнейшее зарождение и способствовать контролируемому росту кристаллов. При выращивании кристаллы необходимо защищать от физического или химического повреждения.

Контроль системы необходим, чтобы сохранить ее чистой, полностью определенной и неизменной, от начала до конца. Это предотвращает введение примесей в растущий кристалл и обеспечивает воспроизводимость в лабораторных условиях.

К сожалению, этот процесс зависит от целого ряда биохимических, физических и химических факторов. Это делает стандартизацию кристаллизации белка досадной задачей, с необходимостью понимания правильной смеси химических веществ, поведения белка в разных фазах и зарождения, а также роста кристаллов. Роботизированные системы для обработки этих процессов автоматически и точно, в количествах нанолитера, были разработаны для более крупных лабораторий, но часто слишком дороги для небольших установок.

Таким образом, кристаллизация белка остается искусством и наукой, которая все еще находится в стадии разработки. Рост кристалла, единица которого представляет собой макромолекулу, состоящую из тысяч и тысяч атомов в сложных устройствах в первичных, вторичных и третичных структурах с разной степенью свободы, возможной для каждого атома, является обязательной задачей, которая по-прежнему управляется эмпирическим знанием.