» » » Молекулярное клонирование


Молекулярное клонирование относится к репликации и рекомбинации молекул ДНК. Первые эксперименты по клонированию были проведены в 1970-х годах, когда были открыты рестрикционные эндонуклеазы. Рестрикционные эндонуклеазы представляют собой ферменты, которые избирательно расщепляют и редуцируют ДНК подобно паре ножниц.

Эти ферменты позволили ученым вырезать определенную часть ДНК, обычно ген, и вставлять ее в вектор, где он может быть скопирован. В этом процессе также могут быть внесены изменения в клонированный сегмент ДНК. Клонирование стало основополагающим методом молекулярной биологии и является основой для большей части того, что известно сегодня о генетике.

Основным процессом клонирования является выделение ДНК-последовательности из любых видов и ее вставка в кусок ДНК-носителя, называемый вектором, для распространения внутри вида хозяина, который обычно представляет собой бактерии или дрожжи. Эти клоны затем могут быть использованы для генетического анализа, получения белка, мутаций и многих других целей.

Рабочий процесс клонирования протекает в четыре этапа:

  • Изолирование ДНК
  • Изолированную ДНК вставляют в клонирующий вектор
  • Векторы распространяются в хосте
  • Выбираются хосты, содержащие вставку ДНК

Выделение ДНК

Эксперимент по клонированию начинается с идентификации участка ДНК, который предназначен для клонирования. В большинстве случаев этим участком является полный ген. Наиболее распространенным методом копирования гена является полимеразная цепная реакция (ПЦР). ПЦР усиливает только нужный участок ДНК.

После амплификации ДНК концы готовят для лигирования рестрикционными ферментами. Рестрикционные ферменты выбирают для их совместимости с желаемым вектором. Затем сегмент амплифицированного гена инкубируют с рестрикционными ферментами, чтобы разрезать концы, поэтому существует соответствующий навес для лигирования.

В то же время, вектор готов к получению ДНК с теми же самыми нависающими концами.

Вектор обычно содержит другие гены, которые полезны для клонирования, такие как промоторы и гены для устойчивости к антибиотикам, которые могут быть использованы для отбора.

Лигирование

Во время лигирования амплифицированный ген, подлежащий клонированию, инкубируют с вектором. Концы каждого из них были получены с помощью рестрикционных ферментов, чтобы иметь дополнительные нависающие фрагменты одноцепочечной ДНК. Нуклеиновые кислоты на этих нависающих срезах создают пара друг с другом, после чего лигазный фермент используется для закрытия зазоров между нуклеиновыми кислотами.

Преобразование

Как только ДНК будет подготовлена, она должна будет распространиться в бактериях. Процесс индуцирования бактерий захвата ДНК-ДНК называется трансформацией. Бактерии обычно готовят для трансформации путем обработки хлоридом кальция.

Трансформированные бактерии выращивают в культуре. Затем применяют метод, которым можно будет выбрать только те бактерии, которые поглотили и экспрессировали векторную ДНК. Наиболее распространенным методом является использование гена устойчивости к антибиотикам, включенного в вектор. В этом случае среда роста для бактерий должна содержать антибиотик, тогда в ней останутся только успешно трансформированные бактерии.

Первый эксперимент по молекулярному клонированию был завершен в 1973 году. Теперь этот метод стал обычным явлением и было внедрено множество новшеств, чтобы сделать молекулярное клонирование быстрее, проще, надежнее.